导语
直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一，是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法，其中常用的方法有BrdU标记法。
原理：
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定)，从而判断细胞的增殖能力。
操作步骤：
(1)细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片)，培养1 d，用含0.4% FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。
(2)加入BrdU(储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml)，37℃，孵育40 min。
(3)弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。
(4)甲醇/醋酸固定10 min。
(5)经固定的玻片空气干燥，0.3% H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。
(6)5%正常兔血清封闭。
(7)甲酰胺100℃，5 min变性核酸。
(8)冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。
(9)按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数(LI)。
注意事项：
1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存
2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。
摘自：细胞之邦（微信：bbs-abbiomall）
